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克隆常见问题解答

发布时间:2019-05-15 11:46:03 点击次数:

Q:如何选择合适的克隆载体?

A:Taq系列酶扩增的片段,选用T载体;Pfu系列酶扩增片段,选用Blunt系列载体,也可以加“A”后和T载体连接,但效果不如直接连接Blunt系列载体。如果PCR模板是质粒DNA,推荐使用双抗性载体。


Q:插入片段的量多少合适?

A:

• 片段加入量可根据片段长度不同进行调整。 最佳插入片段DNA量:载体与片段摩尔比=1:7

• 可以粗略的按照“1 kb 20 ng”的比例计算。(如1 kb加20 ng,1.5 kb加30 ng等)、(在胶上通过TransGen的DNA 分子量标准粗定量即可)

• 片段加入量最大为4μl,即使片段浓度很低也不要超过此限。片段加入量最少为0.5μl,可以补充无菌水以方便操作。

• 反应温度范围:20-37℃,最适反应温度为25℃。


Q:反应时间多长合适?

A:

• 大多数1 kb以内的PCR产物室温反应5分钟即可完成反应。以下几种情况可以延长反应时间以获得更理想的效果:

• 具有特殊结构(高AT/高GC/反向重复序列)的片段:10-20分钟。

• 胶回收片段或加"A"片段:10-15分钟(该条件适用于3 kb以内的片段)。

• 大于3 kb的PCR产物需延长至15-20分钟。


Q:连接产物可以保存多久?

A:连接产物可以置于-20℃或2-8℃冰箱,一周内使用。


Q:多克隆位点上的酶切位点切不开?

A:筛选到的克隆来源于模板质粒而不是连接产物。推荐使用双抗载体,筛选时使用模板质粒不具有的抗性。


Q:克隆数少或阳性率低?

A:

• 影响克隆数目和克隆效率的因素有许多,如感受态细胞效率、插入片段质量、基因结构、插入片段长度、插入片段和载体的比例等。如发现克隆数少或克隆效率低,可尝试下列方法:

• 感受态细胞的转化效率对克隆数有重要影响,转化效率高低与连接产物克隆数的多少不呈线性关系。假设细胞转化效率为1×109 cfu/µg DNA时,克隆数为1000;转化效率为1×108 cfu/µg DNA时,克隆数并不是100,而是低于100。为保证克隆数,请选用高转化效率的Trans1-T1感受态细胞。

• 使用新鲜的PCR产物:PCR产物于2-8℃保存,1-2天内使用。对于胶回收产物,应尽量缩短紫外照射时间并适当延长反应时间 (10-15分钟)。

• 目的片段浓度极低时,进行浓缩,以保证反应时分子碰撞机率。

• 毒基因:使用Trans10感受态细胞。

• 具有特殊结构 (高AT/高GC/反向重复序列) 的基因:适当延长反应时间至10-20分钟。


Q:PCR鉴定重组子失败?

A:当用通用引物鉴定重组子,没有得到目的扩增产物,又没有载体自连带,说明PCR失败。重新优化PCR条件或提取质粒,以质粒作模板扩增或酶切鉴定包含重组子的克隆。


Q:重组克隆呈现淡蓝色或“Fish eye”?

A:插入片段没有影响LacZ基因读码框,或插入片段太短 ,这种情况下克隆呈现淡蓝色或“Fish eye”,可正常鉴定。


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