玖玖资源365

<p>细胞培养常见问题解答</p>

Q:培养基 pH 值异常

A:

• 二氧化碳分压设置错误:根据培养基中碳酸氢钠的浓度而增加或降低培养箱中二氧化碳分压。

• 培养箱无二氧化碳:定期观察二氧化碳压力表,及时更换二氧化碳钢瓶。

• 细胞培养瓶盖拧得过紧:将盖子旋松 1/4 圈,或换成透气盖培养瓶。

• 细菌、真菌污染 丢弃细胞和培养基。

• 培养基中的平衡盐不匹配:二氧化碳平衡环境中使用以 Earle's 平衡盐为基础的培养基,大气条件下使用以Hank's 平衡盐为基础的培养基。

• 碳酸氢盐缓冲系统缓冲能力不足:加入 HEPES 缓冲液,使其终浓度为 10-25 mM。


Q:细胞生长缓慢

A:

• 培养基或血清改变:比较不同培养基中葡萄糖、氨基酸等成分有无差异;增加细胞接种密度;更换新鲜培养基。

• 必需生长促进成分 ( 如 L- 谷氨酰胺或生长因子 ) 缺乏、耗尽或降解使用新鲜培养基或向现有培养基中添加必需成分。

• 细胞初始接种密度过低:增大细胞接种密度。

• 支原体污染:检测培养物有无支原体污染,如果被污染,则弃之,或用支原体清除试剂进行清除。

• 细胞代次过高:取用新的细胞。

• 轻度细菌或真菌污染:在添加抗生素的培养基中培养细胞,如果培养物被污染,则弃之。

试剂储存不当血清应置于-5℃至 -20℃下储存 ;培养基应置于 2-8℃下避光储存;完全培养基应置于2-8℃下避光储存,并限在2周内使用。


Q:细胞死亡

A:

• 胰酶消化过度:缩短胰酶消化时间或降低消化用胰酶的工作浓度。

• 细胞状态差:取用新的细胞。

• 支原体污染:检测培养物有无支原体污染,如果被污染,则弃之,或用支原体清除试剂进行清除。

• 培养基中无附着因子:如采用无血清培养方法,应确保其含有附着因子,或使用包被过的培养器皿。

• 培养箱中无二氧化碳:定期观察二氧化碳压力表,及时更换二氧化碳钢瓶。

• 培养箱温度有波动:监测培养箱内温度。

• 转染试剂毒性过强,细胞代次过高,质粒纯度差使用低毒性的转染试剂或在转染后及时换液;使用低代次细胞转染 ;使用高品质的质粒转染。

• 细胞解冻或冻存过程中损伤大:取用新的细胞。

• 培养基的渗透压不正确:检查完全培养基的渗透压。大多数哺乳动物细胞可耐受的渗透压为 260-350 mOsmol/kg,昆虫细胞可耐受的渗透压为 340-380 mOsmol/kg。

• 培养基中有毒代谢产物蓄积过多:更换新鲜培养基。


Protein Marker使用常见问题解答

Q:条带模糊的原因?

A:

• 电压过高或电泳时间过长,产热过多导致电泳缓冲液温度升高。建议参照Trans产品使用说明书。

• 电泳缓冲液陈旧,建议使用新鲜的电泳缓冲液,为了获得理想的结果建议在使用前预冷缓冲液。

• 分离胶的浓度偏低,建议使用合适的胶浓度。

• 凝胶放置时间过长,建议使用新配制的凝胶电泳。


Q: 为什么有时候带型不整齐?

A:

• 建议点样时将蛋白Marker放在泳道中间。如在凝胶两侧泳道,由于边缘效应、离子强度不均等原因,均会导致带型变宽或弯曲。

• 凝胶配制不匀,凝胶内存有气泡,或点样孔中有细碎的残胶。


Q:电泳时蛋白Marker分离不开?

A:大多为胶浓度不合适,要在推荐的凝胶浓度范围内使用。此外,比较陈旧的凝胶和缓冲液也会造成电泳效果不好。


Q:预染Marker电泳后清晰,但是转膜后颜色很浅?

A:

• 转膜时一定要将胶和膜压紧,否则条带会在转膜过程中丢失或变浅。

• 转膜条件不适合,建议200 mA、2小时,或100 mA过夜转膜。


Q:转膜时甲醇的浓度是多少,会对转膜造成什么影响?

A:甲醇的浓度一般推荐为15%,甲醇浓度太高易造成蛋白穿膜,转移到滤纸上。


Q:发光液配制需要避光吗?

A:不需要避光,但是要现配现用,配制后马上进入暗室进行下面的操作。


Q:发光液的有效曝光时间多长?

A:发光液在2小时以内均可以曝光,但是前30分钟曝光能力较强,随着时间的推移可适当延长曝光时间来调节曝光强度。


Q:曝光后X光片背景很黑是什么原因?

A:背景很黑可能是曝光时间太长或者显影时间过长造成的。


Q:Western Marker 曝光后杂带很多是什么原因?

A:Marker上样量过多或曝光时间过长,可适当减少上样量或曝光时间。此外,二抗的浓度过高或特异性和纯度不高,也会造成杂带较多的结果。


His标签蛋白纯化常见问题解答

Q:层析柱堵塞?

A:待纯化蛋白样品中存在固体杂质,多见于菌体裂解液直接上样。建议对样品微滤 (0.45μm) 处理。


Q:目的蛋白不与介质结合?

A:

• 目的蛋白没有 His 标签,其原因可能是载体构建有误、表达提前终止 (C端融合表达His 标签)、二级翻译起始 (N端融合表达His标签)等等。建议测序检查,或尝试更换表达载体。

• His标签折叠在蛋白质内部没有暴露。该情况多见于包涵体蛋白在变性条件下的纯化。建

议充分变性蛋白,可以尝试使用更强的变性剂 (如用6 M盐酸胍代替 8 M尿素)、加入助溶剂 (SDS) 或还原剂 (DTT、β-巯基乙醇) 等方法。

• 缓冲液存在问题。使用 Ni-NTA 或 Ni-IDA 介质纯化 His 标签蛋白时,平衡缓冲液与样品缓冲液中的某些组分可能会干扰目的蛋白的结合。

部分组分建议浓度如下 :

 EDTA: ≤0.1 mM (建议不要使用)

 DTT: ≤1 mM (不推荐使用)

 β-巯基乙醇: ≤20 mM (慎用)

 咪唑: ≤20 mM (因蛋白而异)


Q:洗脱液中杂蛋白多?

A:

• 洗脱条件不合适。建议使用咪唑浓度梯度或 pH 值梯度洗脱。不同蛋白质最佳洗脱条件不同,需要摸索优化。

• 杂蛋白与介质存在非特异性结合。建议在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入一定浓度的咪唑 (推荐浓度 : ≤20 mM,因蛋白而异),抑制非特异性结合。

• 杂蛋白与目的蛋白存在非特异性结合。建议在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入非离子型去垢剂 (Triton X-100: ≤1%)、甘油 (≤10%)、NaCl (≥300 mM)、还原剂 (β- 巯基乙醇 : ≤20 mM) 等组分。

• 目的蛋白降解。建议在低温下纯化目的蛋白,并在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入蛋白酶抑制剂 (如 PMSF)。

• 存在表达提前终止 (C 端融合表达 His 标签) 或二级翻译起始 (N端融合表达 His 标签)。建议更换表达载体。


Q:目的蛋白没有洗脱?

A:

• 目的蛋白量太少,无法检出。建议更换灵敏度更高的检测方法,如用银染法或 Western Blot 替代考马斯亮蓝染色,或优化上游表达条件,获得更多的目的蛋白。

• 目的蛋白没有结合介质。建议检测以下全部样品以确认蛋白:上样前、流出、洗涤、洗脱。

• 目的蛋白结合牢固。建议增加洗脱强度,如采用更高浓度的咪唑或更低的 pH 值。


原核蛋白表达常见问题解答

Q:蛋白不表达或表达量很低?

A:

1、选择正确的表达载体与表达菌株

• T7启动子的载体(如pET系列载体)应选用BL21(DE3),BL21(DE3) pLysS,Transetta(DE3) 等菌株。非T7启动子的表达载体 (如Tac启动子的pGEX、pMAL系列表达载体) 应选用BL21表达菌株。

• 对细胞有毒性的蛋白,建议选用背景表达低、严谨调控诱导的菌株,如BL21(DE3) pLysS菌株。

• 对于带有稀有密码子的蛋白或来源于真核基因的蛋白,建议选用Transetta(DE3) 等菌株。

2、尝试不同的表达载体与菌株

   不同的蛋白,对不同载体与菌株的偏好不同,如果某一蛋白无法通过优化诱导表达条件得到明显改善,可以更换其它菌株或表达载体。

3、表达条件的优化

• 选择不同的培养基。对于某些蛋白,在培养基中加入适量的葡萄糖(0.1%-0.5%),可以明显提高表达量。

• 较高的温度、较高的诱导物浓度、较长的表达时间,一般可以加快表达的速度,促进目的蛋白的积累,从而提高表达量。但可能会降低可溶蛋白的表达量,形成包涵体。

• 细胞的生长状态对蛋白表达有很大的影响,可以通过测量菌液的OD600值监测生长状态。对于大部分蛋白,应在菌株的对数生长期(OD600=0.5) 进行诱导。


Q:目的蛋白不可溶,形成包涵体?

A:

首先确认目的蛋白是否有表达。

• 裂解菌体并离心后,通过对全菌、上清、沉淀的检测,确认目的蛋白是否表达,是否形成了包涵体。

• 包涵体的形成与蛋白自身结构、表达系统、诱导表达条件等因素有着密切关系。在无法改变蛋白自身结构的情况下,可以尝试不同的表达载体与菌株,增强其溶解能力,优化出适合特定蛋白的表达系统。

• 目前认为包涵体的形成是由于蛋白在细胞内积累速度过快,没有正确折叠而聚集沉淀。可以通过优化诱导表达条件,如降低诱导温度、降低诱导物浓度、缩短表达时间、降低诱导时菌液的OD值等,以减缓蛋白的积累。


Q:目的蛋白大小不正确?

A:

• 蛋白的结构对判断分子量大小有一定影响。可以通过加热变性蛋白,从而准确判断蛋白分子量大小。

• 确认蛋白表达是否完整,蛋白是否提前终止表达。

• 若形成二聚体甚至多聚体,可以通过加热变性蛋白、打开二硫键 (加入DTT、β-ME等还原剂) 等手段,破坏次级结构,准确判断分子量大小。


RNA纯化常见问题解答

Q:提取过程中 RNA 降解

A:

• 材料中的 RNA 发生降解:尽量选择新鲜的材料,材料采集后应迅速用液氮处理。材料

保存在液氮中或 -70℃条件下,材料均不宜长期保存,且避免反复冻融。幼嫩新鲜的材料 RNA 含量高且完整,衰老或病害等受损的材料中 RNA 降解比较严重。

• 操作环境的 RNase 污染:RNA 提取尽量选择洁净的环境,由于自然条件下空气中含有较多的 RNase,建议对提取环境进行 RNase 的清除处理。

• 提取用具带来的 RNase污染:提取用所有的玻璃器皿可通过高温灭活 (160℃烘烤 4-5 小时)去除 RNase。RNA 材料所接触的所有塑料制品 (如枪头、电泳槽、移液器等)都需要通过 DEPC 或 NaOH 处理严格去除 RNase 后才可使用。

• 操作中带入的 RNase 污染:人的皮肤、汗液和呼出的气体中含有大量的 RNase。操作人

员可通过经常更换一次性手套,佩戴口罩等措施减少此类污染。


Q:RNA 提取量低

A:

• 材料 RNA 含量较低:对于 RNA 含量较低的纤维组织 (肌肉组织或纤维素较高的植

物组织) 可适当提高起始材料的用量。

• 材料中蛋白和脂肪含量较高:蛋白和脂肪含量较高的材料可用氯仿对上清再次抽提。

• RNA 沉淀条件不合适:使用异丙醇沉淀 RNA 时,加入的异丙醇与提取液的比例为严

格的 1:1,否则会明显影响 RNA 沉淀的效率和 RNA 的纯度。特殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通过添加适量的柠檬酸钠来改善沉淀效果。


Q:RNA 中有基因组 DNA 污染

A:

• 材料中核酸含量高:脾脏、胸腺等组织中的核酸含量较高,可进行多次酚 / 氯仿抽

提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 处理,降解 DNA。

• 材料过量:增加试剂用量。

• RNA 沉淀条件不合适:使用异丙醇沉淀 RNA 时,加入的异丙醇与提取液的比例偏高,

溶液的 pH 值偏小,都容易使 DNA 形成沉淀。


Q:提取后的 RNA 样品降解

A:

• RNA 样品反复冻融:反复冻融会使 RNA 片段断裂,影响 RNA 的完整性。

• RNA 样品保存条件不合适:根据保存时间和材料的不同,RNA 应保存在不同的溶液中。

如从胰脏、肝脏等 RNase 含量较高的材料中提取的样品需要储存在甲醛或甲酰胺中以保存高质量的 RNA,而在脾脏中提取的 RNA 可在水中长期稳定保存。


全式金生物官方微信号--'transgen'
关闭